人骨髓單個核細胞分離液實驗方法 產品編號：TBD2013CHU 產品名稱：人骨髓單個核細胞分離液試劑盒 技術文檔編號：TBD0024SOP 【產品規格】 200ml/Kit 【產品組成】 為方便廣大用戶使用，試劑內容如下： 名稱 產品編號 規格 A XXXX 動物骨髓單個核細胞分離液 200ml B 樣本稀釋液（贈品） 2010C1119 200ml C 清洗液（贈品） 2010X1118 200ml D F 液（贈品） F2013TBD 200ml E 說明書 1 份 【實驗前準備】 適用儀器：最大離心力可達 1200g 的水平轉子離心機 【檢驗方法】 全過程樣本、試劑及實驗環境均需在 20±2℃的條件下進行。 1.首先制備骨髓單細胞懸液，制備方法詳見“骨髓沖洗單細胞懸液制備技術”。 2.取一支 15ml 離心管，加入與骨髓單細胞懸液等量的分離液（注：分離液最少不得少于 3ml）。 3.用吸管小心吸取骨髓單細胞懸液加于分離液液面上，400-500g，離心 20-30min。（注：根據骨髓單細胞懸液量確定離心條件，骨髓單細胞懸液量越大，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到最佳分離效果）。 4.離心后，此時離心管中由上至下分為四層。第一層為稀釋液層。第二層為環狀乳白色單個核細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。 5.用吸管小心吸取第二層環狀乳白色單個核細胞層到另一 15ml 離心管中，向離心管中加入 10ml 清洗液（產品編號：2010X1118），混勻細胞。 6.250g，離心 10min。 7.棄上清。 8.用吸管以 5ml 清洗液（產品編號：2010X1118）重懸所得細胞。 9.250g，離心 10min。 10.重復 7、8、9，棄上清后以 0.5ml 后續實驗所需相應液體重懸細胞。 分離圖例 【注意事項】 1.全過程樣本、試劑及實驗環境均需在 20±2℃的條件下進行。為獲得最佳的實驗結果，最好在取樣 2h 內進行實驗，樣品存放時間越長，細胞分離效果越差。樣品放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達到分離目的。 2.本實驗最好不要使用高聚合材質（如聚苯乙烯）的塑料制品，應使用無靜電、低靜電離心管及未經堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面會變成毛面，影響細胞分離效果。 3.吸取過多的單個核細胞層及分離液層會導致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒細胞數量增加。 4.分離液用量大于骨髓單細胞懸液樣本時，分離效果更佳。 5.如實驗后細胞得率或活性過低，請聯技術支持以尋求幫助. 【儲存條件及有效期】 常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現白色結晶，影響分離效果。 【參考值（參考范圍）】 本實驗單個核細胞提取率及純度大于 80%。 下表為成年人外周血中各種細胞的數量及比例，用戶可適當進行參考。 紅細胞 白細胞 血小板 （4.0-10.0）×109 含量（個/L） （4.0-5.5）×1012 中性粒細胞 淋巴細胞 單核細胞 （1.0-3.0）×1011 50%-70% 20%-40% 3%-8% 【相關實驗技術方案】 1.骨髓沖洗單細胞懸液制備技術。 2.所獲得單個核細胞的培養技術。 3.所獲得單個核細胞的核酸提取技術。 4.所獲得單個核細胞的鑒定方法A.流式細胞技術B.免疫組化技術C.原位雜交技術 D.PCR 技術 【可能存在的問題及解決方法】 1. 由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示： 出現情況 出現原因 建議解決方案 離心后目的細胞存在于血漿層或稀釋液層 轉速過小或離心時間過短 適當增減轉速 離心后目的細胞存在于分離液中 轉速過大或離心時間過長 離心后白環層彌散 細胞密度過大 調整細胞密度 離心后白環層太淺或看不見 細胞密度過小 2.本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關。不同地區客戶可根據當地情況對離心條件進行適當調整。建議對離心條件進行調整時，恒定離心時間，對離心轉速進行調整。 3.本分離液依照國際標準，全部使用藥用級原料，性能指標與國產同類產品略有不同，可 能出現紅細胞沉降不完全的情況，可以適當加大離心轉速。 注：在對離心條件進行調整時，離心轉速的加減以 50-100g 為基數，直至達到最佳分離效果，離心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準。