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產(chǎn)品信息：
 

組分	JCL073-01 (20次)	JCL073-02 (20次×3)
pBM18A Vector (20ng/ml )	20ml	20ml×3
10×Toposmart	20ml	20ml×3
Control Insert LacZα	5ml	5ml
M13F(-47) Primer	0.1OD	0.1OD×3
M13R(-48) Primer	0.1OD	0.1OD×3

產(chǎn)品介紹：
pBM18ATopotsmart克隆試劑盒利用痘苗病毒的拓?fù)洚悩?gòu)酶I(Topoisomerase I)的切割再連接的特點(diǎn)將片段克隆到載體中，不僅適用于克隆由Pfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5等高保真DNA聚合酶擴(kuò)增的平末端PCR產(chǎn)物，也可克隆由Taq、Tth和klenTaq等DNA聚合酶擴(kuò)增的帶A尾的PCR產(chǎn)物。陽性克隆可用M13F(-47)和M13R(-48) 引物進(jìn)行菌落PCR鑒定。SmaI和XhoI單酶切可將克隆片段酶切出來。載體的多克隆位點(diǎn)兩側(cè)具有SP6和T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子序列， 可用于體外RNA轉(zhuǎn)錄。載體不含LacZ基因，不能進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1. 使用各種DNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。
2. PCR 引物 5’端不能進(jìn)行磷酸修飾，普通商業(yè)化引物即可。
3. 載體采用了新的制備工藝，無需藍(lán)白斑篩選。
4. 載體具有氨芐青霉素抗性。操作步驟

1. 連接反應(yīng)

按下表，在一個(gè) 0.2ml PCR 管中依次加入
 

成分	體積
DNA 片段	0.5-8ml
pBM18A Vector	1ml
10×Toposmart	1ml
補(bǔ)水至總體積	10ml

加完試劑后，輕輕混勻低速離心，使溶液集中在管底。注意：此步驟不要在低溫條件下（冰水?。┥喜僮?。

2. 反應(yīng)溫度及片段要求

室溫下（20-30℃）放置 5-30 分鐘，然后將離心管放置在冰上。如當(dāng)天不進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。請(qǐng)將連接產(chǎn)物置于-20℃保存。
注意：DNA 片段的用量見下表
 

片段大小（bp）	最佳用量（ng）
100-1000	20-50
1000-2000	50-100
2000-5000	100-200

室溫下（20-30℃）反應(yīng)時(shí)間 5-30 分鐘，如果室溫較低，推薦使用 PCR 儀控溫。可以設(shè)置 25℃反應(yīng) 5-30 分鐘。如果 PCR 產(chǎn)物電泳檢測(cè)僅有很銳利明亮的條帶， 無引物二聚體和非特異性條帶存在，可直接取 0.5-1ml 的 PCR 產(chǎn)物原液進(jìn)行克隆。

3. 陽性對(duì)照反應(yīng)

取 1ml 試劑盒提供的 1kb 長(zhǎng)度的對(duì)照片段 LacZ 基因 α肽片段進(jìn)行克隆，轉(zhuǎn)化具有α互補(bǔ)功能的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（如 DH5α,TOP10,Mach1T1 等）。菌液涂布在含有 IPTG 和 X-gal 的 LB 氨芐平板上，次日藍(lán)色菌落為陽性克隆，說明有片段插入，白色菌落為空載體。

4. 轉(zhuǎn)化

（1）取 5ml 連接產(chǎn)物到 50-100ml 剛剛?cè)诨母惺軕B(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴
20-30 分鐘。
（2）42℃水浴中熱擊 30 秒。
（3） 立刻置于冰水浴中 2 分鐘。
（4） 加入 300-500μl 無菌的不含抗生素的SOC 或 LB，37℃，200-250rpm 振蕩培養(yǎng) 60 分鐘。
注：小于 2kb 片段可以不復(fù)蘇，直接涂平板。
（5） 吸取 200ml 菌液涂布。為了得到更多的菌落，可以先 4000rpm 離心 1 分鐘，去掉部分上清，用移液器輕吹菌體，充分懸浮菌液，取全部菌液涂布，然后37℃培養(yǎng)過夜（12-16 小時(shí)）。
5. 陽性重組子的鑒定菌落 PCR
（1） 菌落PCR方法鑒定陽性克隆

① 用10ml吸頭挑選克隆至預(yù)先加有10ml無菌水或LB培養(yǎng)基的PCR管中， 吹打混合。
② 25ml PCR反應(yīng)體系：取2ml細(xì)菌懸液為模板、加入5mM 濃度的M13F(-47)、
M13R(-48)各1ml進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
③PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5分鐘（裂解細(xì)胞，失活核酸酶），94℃變性10秒鐘，55℃退火10秒鐘，72℃延伸（ 根據(jù)片段的大小決定延伸時(shí)間，通常每1min/1kb）X秒，30個(gè)循環(huán)，72℃后延伸5分鐘。1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果，有強(qiáng)烈的明顯條帶的克隆為重組體，與插入片段大小相近【M13F(-47)、M13R(-48)引物在克隆位置的兩側(cè)，所以PCR 擴(kuò)增出的DNA的長(zhǎng)度比插入片段大229bp】可視為陽性克隆。菌落PCR 方法鑒定重組子時(shí)一定要設(shè)立一個(gè)不加菌液的陰性對(duì)照。
（2） 測(cè)序：用M13F(-47)、M13R(-48)通用引物對(duì)陽性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析。

6. 

pBM18A載體圖譜7. 常見問題分析
(1) 重組子克隆菌少，或陽性率低：感受態(tài)效率低，使用轉(zhuǎn)化效率>5×107cfu/μg 的感受態(tài)細(xì)胞
(2) 連接反應(yīng)在低溫下（如放碎冰上）操作，應(yīng)該在室溫下操作。
(3) PCR 片段加入量太多或太少，按照推薦量加入。
(4) PCR 純度低，重新擴(kuò)增或重新純化 PCR 產(chǎn)物。
(5) PCR 質(zhì)量低，切膠時(shí)在紫外下照射時(shí)間長(zhǎng)，需重新制備。
(6) PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，應(yīng)該再延伸 5-10 分鐘，確保片段延伸完全。
(7) 轉(zhuǎn)化后沒有復(fù)蘇培養(yǎng)，可以加入SOC 或 LB，培養(yǎng) 60 分鐘?？寺』蚩?/div>
能對(duì)宿主菌有毒性，比如某些編碼膜蛋白和DNA 結(jié)合蛋白的基因，某些啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)序列基因，或含有倒置或串聯(lián)重復(fù)序列的基因，選用室溫過夜培養(yǎng)平板，或換用低拷貝質(zhì)粒載體。

載體序列：

>pBM18A 1952bp AAAGGCCCACCCGTGAAGGTGAGCCAGTGAGTTGATTGCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA AAACGACGGCCAGCCAATTGAAGCTATTTAGGTGACACTATAGATATCGAGCTCGAGGATCCATGGTA
CCCGGGCGTGTCG CGACACGCCCGGGTCTAGACTGCAGCTCGAGGCATGCAAGCT
TTGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCCATCCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCGT CCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAAC TTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAA GGAAGCTAAAATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTC CTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTG GGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCC AATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGC AACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCAT CTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGC CAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATC ATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACC ACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTC CCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTC CGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCA CTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGA TGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAATGAGGGCCCAAAT GTAATCACCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCC CCTGACGAGCATCACAAAAATCGATGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATA CCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACC TGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCG GTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTT ATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTG GTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTAC GGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTCGGAAAAAGAGTT GGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGAT TACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATTTTCTACCGAAG
本產(chǎn)品僅供研究，不用于臨床診斷

上海研謹(jǐn)生物是一家專業(yè)從事生化試劑、分子生物學(xué)試劑、實(shí)驗(yàn)耗材及實(shí)驗(yàn)儀器研發(fā)、銷售、服務(wù)為一體的專業(yè)性生物科技公司。目前公司銷售、代理：Invitrogen、Amersham、sigma、Aldrich、Amresco 、YOYOBIO、BD（Difco）、Thermo、Fluka、Merck、Omega、PALL、Millipore、Peprotech、Pierce、Roche、Eppendorf、 BioHiT、Whatman、Axygen、corning、Pharmaia、等諸多品牌。 0 
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