酪蛋白酶譜MMP（3/10）檢測實驗
 
實驗方法介紹
基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)酪蛋白酶譜法(casein-zymography) 電泳分析試劑是一種旨在通過酪蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法，在分離、蛋白復(fù)性、底物水解、染色等系列步驟下，觀察并半定量深藍(lán)色背景中的白色清晰的基質(zhì)金屬蛋白酶條帶,根據(jù)分子量確定特異基質(zhì)金屬蛋白酶及其活性的權(quán)wei而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取樣品(動物、人體、植物、昆蟲等)、培養(yǎng) 上清懸液、血清和關(guān)節(jié)滑液或腦脊液等基質(zhì)金屬蛋白酶- 1, 3,7以及12等活性及其抑制劑的檢測。
 
實驗技術(shù)背景
基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases; MMPs) 是類結(jié)構(gòu)高度同源的分泌型或膜相關(guān)性鋅內(nèi)肽酶的總稱，因含有金屬(鋅、鈣)離子而得名。迄今為止發(fā)現(xiàn)的MMPs至少有28種,幾乎能降解除多糖以外的全部細(xì)胞外基質(zhì)(xtracellular matrix)成分，同時參與胚胎發(fā)育、形態(tài)形成、胚泡植入(blastocyst)、血管形成、 組織再吸收(tissue resorption)、 疾病發(fā)生，例如關(guān)節(jié)炎、癌細(xì)胞浸入轉(zhuǎn)移等根據(jù)降解的底物不同可將MMPs分為4大類:
 
(1)膠原酶: MMP1、MMP8、MMP13 主要消化I、II、 II、 VII、 X型膠原和蛋白多糖;
 
(2)明膠酶(IV型膠原酶) : MMP2、MMP9,又稱明膠酶A、B, 主要消化IV、V. VII、 X型膠原和彈性纖維;
 
(3)基質(zhì)溶解素: MMP3、MMP7、MMP16、MMP11,主要作用于纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、彈力纖維、II、IV、V. VII、IX膠原及MMP1、 MMP8、 MMP9;
 
(4)膜型金屬蛋白酶: MT1-MMP、 MT2-MMP、 MT3-MMP，主要作用于明膠、IV型膠原、MMP2。體內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞并不儲備MMPs，當(dāng)需要MMPs的信號傳遞到細(xì)胞后才臨時合成，合成的MMPs 以無活性的酶原(proenzyme) 形式分泌到細(xì)胞外，隨后被多種蛋白酶和非蛋白酶水解以及熱處理激活，一種激活的MMPs可激活另一種MMPs, 形成瀑布效應(yīng)。酪蛋白酶譜法(casein-zymography) 電泳分析技術(shù)使用-酪蛋白作為酶的底物，具有簡便,無需抗體，同步觀察多種酶以及活化與否的優(yōu)勢。
 
研謹(jǐn)生物酪蛋白酶譜法MMP3/10檢測實驗服務(wù)案例介紹
 
本實驗采用酶譜法(zymography)檢測MMP-3、MMP-7、 MMP-10活性，Zymography是一種基于SDS-PAGE電泳的蛋白酶檢測方法，其靈敏度可達(dá)1 nM (10~100 pg),高于ELISA方法。通過制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE凝膠，含蛋白酶的樣品在凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng)Bufer孵育,凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置,蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區(qū)域,從而能同時指示MMP-3/10的大小位置(酶譜)及活性。
 
樣品準(zhǔn)備要求
 
1)血漿/血清/上清或體液樣品準(zhǔn)備:血漿或血清樣本加入1/10體積的檸檬酸鈉，1000rpm離心20分鐘， 留取上清，以BCA法測定蛋白濃度，測定濃度以后，取約30ug蛋白上樣進(jìn)行電泳檢測。樣本準(zhǔn)備后可暫時4°C保存，不立即測定的樣品需 -70°C保存,但不宜超過10天。
 
2)組織樣本準(zhǔn)備:取100mg新鮮組織以2m勻漿液進(jìn)行勻漿(勻漿劑: 0.1M Tris/ HCI/pH 7.4 ,0.5%TritonX-100, 0. 1mg/ml PMSF)，12000g 4°C離心5分鐘，移取上清層至另一新的1m離心管待測，取30ug蛋白上樣進(jìn)行電泳檢測。樣本準(zhǔn)備以后，樣品可暫時4°C保存,不立即測定的樣品需 -70°C保存,但不宜超過10天。
 
3)細(xì)胞樣本準(zhǔn)備:取1個6孔板細(xì)胞(每孔 細(xì)胞量約2*106個細(xì)胞)， 離心后以500u勻漿液進(jìn)行超聲勻漿(勻漿劑: 0.1M Tris/HClpH 7. 4 ,0.5% TritonX-100，0.1mg/ml PMSF)，12000g 4°C離心5分鐘，移取上清層至另一新的1m離心管待測，取30ug蛋白 上樣進(jìn)行電泳檢測。樣本準(zhǔn)備以后，樣品可暫時4°C保存，不立即測定的樣品需-70°C保存，但不宜超過10天。
 
實驗須知
1)實驗用試劑由實驗室免費提供;
2)檢測系統(tǒng)含陽性參照或內(nèi)參;
3)提供原始膠片;
4)實驗委托方只需提供檢測樣品。
 
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